實時熒光定量PCR的十大不利操作說明

1、引物和探針設計不當

為了*高效地設計用于實時熒光定量PCR的引物和探針，我們強烈建議您使用引物設計軟件。大多數(shù)引物設計程序均包含了可調(diào)節(jié)的參數(shù)以設計*佳的引物和探針。這些參數(shù)涉及了引物/探針的Tm值、互補性、二級結(jié)構(gòu)以及擴增子大小等重要因素。另外還建議您限制連續(xù)的重復核酸數(shù)目。當設計用于真核目標序列的擴增子時，請選擇在目標mRNA中至少跨越一個外顯子-外顯子接合點的PCR引物對，以避免從殘留的基因組DNA模板擴增目標片段。

2、使用了低質(zhì)量的RNA

已降解的或低純度的RNA會抑制反轉(zhuǎn)錄效率并降低得率。所用的RNA應當來自于新鮮組織，或者經(jīng)過RNA穩(wěn)定試劑處理過的組織，如RNAlater短片段試劑（70–250 bp）等。這樣可以避免少部分降解RNA對結(jié)果的影響。若無法使用完全完整的RNA，則可以使設計的引物對與感興趣基因內(nèi)部區(qū)域進行匹配。需要注意的是，對于真正的實時熒光定量PCR，部分降解的RNA可能無法給出基因表達的精que結(jié)果。

3、未使用“預混液”

qRT-PCR是一種分析RNA的高靈敏工具。由于PCR反應會擴增目的基因，所以誤差也會被同時擴增出來。因此，無論何時都應當確保變異處于*低水平。“預混液”是反應試劑的混合液，在設置建立多個反應時應當使用它來*小化樣品間和反應孔間的差異以提高可重復性。為了進一步減少孔間差異，可以向預混液中加入ROX等參比熒光。

4、引入交叉污染

對PCR區(qū)域的所有表面均應當使用DNA去污染試劑來進行日常去污染工作以防止交叉污染，推薦使用如DNAzap的試劑，其可以破壞DNA?？梢允褂谩盁o模板對照“（NTC）來排除試劑和實驗桌面的交叉污染。NTC含有除RNA模板外的所有RT-PCR試劑。通常是用無核酸酶水簡單地替換掉反應中的RNA。反應后NTC中應當沒有合成任何產(chǎn)物；若有產(chǎn)物被合成了，則意味著RT-PCR試劑中的一種或多種被擴增產(chǎn)物污染了。

5、未使用“– RT”對照

在RNA制備過程中，事實上不可能完全去除基因組DNA。因此，在qRT-PCR實驗中有必要加入無逆轉(zhuǎn)錄酶對照（“非擴增對照“，還可記為NAC）。通常，NAC是一個模擬的逆轉(zhuǎn)錄反應，其中含有除逆轉(zhuǎn)錄酶之外的所有RT-PCR試劑。若在NAC中可觀察到產(chǎn)物，通常意味著樣品中殘留有DNA。

6、使用了不適當?shù)木换瘜φ?

任意qRT-PCR實驗的可靠性均可以通過在實驗中引入一個不變的內(nèi)參對照得到改善，這樣做有助于改善qRT-PCR的樣品間差異以及樣品定量過程中的誤差。一個好的對照，其表達水平應當在所分析的樣品中保持不變。通常我們使用18S rRNA作為對照，因為它相比其他傳統(tǒng)內(nèi)參對照如?-actin或GAPDH等表達水平變化更小。

7、使用SYBR Green時未進行熔解曲線分析

理想情況下，實驗樣品在擴增子熔解溫度下會產(chǎn)生一個清晰的峰（一階導數(shù)圖），而NAC及NTC則不會產(chǎn)生任何明顯的熒光信號。這類結(jié)果意味著PCR產(chǎn)物是特異性的，且此時SYBR Green I 熒光是對目的產(chǎn)物的累積的直接測量。若熔解曲線顯示為一系列的峰，則意味著此時很難分辨出特異性及非特異性反應產(chǎn)物。為了獲取有意義的數(shù)據(jù)，這種情況下必須對qRT-PCR進行優(yōu)化。

8、沒有正確地設置基線和閾值線

為了得到精que的Ct值，應當在豐度*高的樣品所對應Ct值兩個循環(huán)之前設置基線。為了使實時熒光定量PCR的數(shù)據(jù)有意義，應當在指數(shù)擴增期設置閾值線。典型情況下，閾值應當設置在基線至少10個標準差范圍內(nèi)。

9、擴增效率低

擴增效率(Eff)可以通過以下公式進行計算：

Eff = 10 (–1/slope) – 1

PCR的效率應當在90-110%之間（3.6 > 斜率 > 3.1）。有一系列變量會影響到PCR的效率。舉例來說，這些因素包括擴增子的長度、二級結(jié)構(gòu)以及引物設計等。盡管擴增效率落在上述范圍之外時，我們也可以得到有效數(shù)據(jù)，但是仍然應當對qRT-PCR進行進一步優(yōu)化或改變擴增子設計。

10、使用不正確的范圍來制作標準曲線

在RNA定量研究（優(yōu)良或相對定量）中或驗證PCR（delta-delta-Ct）的擴增效率時，對于每個基因都應當制備標準曲線。標準曲線數(shù)據(jù)點應當覆蓋您的目標基因期望豐度。額外的數(shù)據(jù)點也可以包括在內(nèi)，例如在極限上下方的*小及*大RNA量等，以幫助區(qū)分特異性和非特異性產(chǎn)物。